ИФА и его роль в диагностике сифилиса

Что представляет собой метод ИФА

Иммуноферментный анализ является основой диагностики многих инфекций, не только венерических и сифилиса в частности. Основан данный метод на определении антител в сыворотке из крови пациента, взятой из вены.

В крови каждого из нас присутствуют особенные структуры белковой природы – антитела, которые представлены разными классами. Одна из главных функций антител – связывание с антигенами и образование определенных комплексов, которые трудно растворяются. За выработку антител ответственны клетки крови – лимфоциты.

https://www.youtube.com/watch?v=kvXjHR8YpxI

При появлении инфекционного возбудителя любого заболевания в крови человека организмом в ответ вырабатываются антитела, которые через свои рецепторы образуют контакт с четко определенными антигенами этого возбудителя. Такой комплекс называется соединением «антигенов антител». И именно метод ИФА при наличии ферментов и специальных меток в реагентах позволяет регистрировать отдельные комплексы антител и антигенов трепонем.

Определение таких комплексов методом ИФА при инфицировании сифилисом стало возможным только при помощи специальных ферментных составов, которые добавляли к исследуемому материалу. Благодаря этому данный диагностический метод стал активно использоваться для определения отдельных классов иммуноглобулинов, которые появляются на фоне определенной инфекции.

Дополнительно при иммуноферментном анализе определяется качественная и количественная реакция, число нарастания титров антител. Такой анализ на сифилис позволяет оценить состояние организма не только после инфицирования, но и после лечения, для отслеживания динамики на фоне полученной терапии.

Иммуноферментный анализ (ИФА) – лабораторное исследование основаное на высокой избирательности и специфичности иммунологических реакций “антиген-антитело”. Различают несколько десятков модификаций ИФА.Наибольшее распространение получил твердофазный гетерогенный иммунный анализ – ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

ИФА применяют для двух целей – для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций,но значительно чаще метод ИФА применяется для определения наличия антител классов ( IgA IgM IgG)  к антигенам различных возбудителей болезней.С помощью ИФА можно определить антитела к любой половой инфекции (при условии,конечно,что организм их выработал) подробнее в статье Иммуный ответ при половый инфекциях.

Клиническая классификация

Диагностика сифилиса имеет некоторые особенности и отличается от диагностики других бактериальных инфекций. Сложное строение и антигенные свойства бледной трепонемы обусловливают ошибки в интерпретации результатов серологических реакций.

Сдать анализ крови на сифилис предлагают 3 основным группам пациентов:

  1. 1Скрининг и диспансеризация групп населения (в том числе и беременность, постановка на учет в женской консультации, поступление на работу и оформление медкнижки и так далее).
  2. 2Скрининг в группах риска (незащищенные половые контакты с человеком, инфицированным сифилисом, лица после принудительных сексуальных контактов, ВИЧ-инфицированные и так далее).
  3. 3Лица, имеющие симптомы заболевания, или лица с подозрением на сифилитическую инфекцию.

Врач-лаборант

Все лабораторные методы условно подразделяют на прямые и непрямые.

1.1. Прямые методы

  1. 1Идентификация Treponema pallidum в тёмном поле (темнопольная микроскопия).
  2. 2Заражение подопытных животных (культивирование в лабораторных животных).
  3. 3ПЦР (полимеразно-цепная реакция).
  4. 4ДНК-зонд или гибридизация нуклеиновых кислот.

1.2. Непрямые методы

Серологические реакции – это методы лабораторной диагностики, базирующиеся на обнаружении антител (сокращенно АТ) к антигенам бледной трепонемы (сокращенно АГ). Они имеют основное значение для подтверждения диагноза.

  1. 1Нетрепонемные тесты:
    • Реакция Вассермана (РСК);
    • Реакция микропреципитации (МР, РМП) и ее аналоги, которые приведены ниже;
    • Тест быстрых плазменных реагинов (RPR, РПР);
    • Тест с красным толуидином и сывороткой (TRUST);
    • Нетрепонемный тест Лаборатории исследования венерических болезней – VDRL.
  2. 2Трепонемные тесты:
    • Р-ция иммобилизации Treponema pallidum – РИБТ/РИТ;
    • Р-ция иммунофлюоресценции – РИФ, FTA (разведения сывороток РИФ-10, РИФ-200, РИФ-абс);
    • Р-ция пассивной гемагглютинации (РПГА, ТРПГА, TPHA);
    • Иммуноферментный анализ (ИФА, EIA);
    • Иммуноблоттинг.

Эти методы сводятся к выявлению особенностей гистоморфологии сифилитических проявлений. Внимание уделяется тонкостям строения твёрдого шанкра. Однако, дифференциальная диагностика инфекции с помощью гистологии весьма затруднительна. Гистоморфология используется с другими лабораторными и клиническими тестами.

Международная статистическая классификация болезней предусматривает деление скрытого (латентного) сифилиса на врожденный скрытый сифилис и приобретенный скрытый сифилис. 

Согласно этой классификации, приобретенный скрытый сифилис делится на ранний, поздний и неуточненный. 

Диагноз 

Все эти виды сифилиса протекают латентно, без клинических проявлений, с неизмененной спинномозговой жидкостью, но с положительными нетрепонемными и трепонемными серологическими тестами в крови.

Подтверждаем или исключаем сифилис: анамнез, симптомы, анализы

Подтвердить или исключить диагноз может только дерматовенеролог. Уролог или гинеколог могут лишь заподозрить болезнь по внешним признакам. И тогда они должны направить пациента к дерматовенерологу для дальнейшего обследования, лечения и наблюдения.

Диагноз «сифилис» основывается на совокупности следующих признаков:

  1. На наличии или отсутствии внешних проявлений и симптомов.
  2. На результатах минимум двух лабораторных исследований: нетрепонемного (РМП, или RW, или RPR) и трепонемного (РПГА или ИФА) тестов.
  3. На данных о том, был ли сифилис ранее, и проводили ли уже его лечение.
  • Наиболее очевидным и обоснованным диагноз считается тогда, когда имеются клинические симптомы и подтверждающие результаты двух анализов: RPR (или RW, РМП) и РПГА (или ИФА).
  • Если же при наличии симптомов результаты анализов расходятся, и RPR отрицательный, а РПГА (или ИФА) положительный, проводят дополнительный трепонемный тест — ИФА (или РПГА, если вначале проводился ИФА). В случае положительного дополнительного анализа диагноз считается доказанным и проводится лечение, в случае отрицательного — кровь отправляют в экспертную лабораторию.
    Отрицательный RPR при положительном ИФА/РПГА встречается обычно в позднем периоде. Тогда на наличие инфекции обязательно исследуют спинномозговую жидкость (РИФ-ц, РИТ).
  • Обратная ситуация, когда RPR положительный, а РПГА отрицательный (или сомнительный) встречаются крайне редко. Это возможно в первые 3–4 недели после появления твердого шанкра, а также во вторичном периоде во время иммунной «прозоны» (чрезмерно большого количества антител). В этом случае анализ рекомендуется повторить.
Предлагаем ознакомиться:  Кандидоз желудка – лечение и симптомы
RPR/
RW/
РМП
РПГА ИФА Лечение проводилось Диагноз Дальнейшая тактика
«Сифилис» Лечение
«Поздний сифилис» Исследование спинномозговой жидкости. Лечение

Тогда диагностика усложняется. Здесь врачи опираются только на анализы и сведения о проводимом или непроводимом ранее лечении.

Варианты в этом случае:

  • Если нетрепонемный (один из РМП/RW/RPR) и трепонемный тест (РПГА/ИФА) — положительны, проводится дополнительный альтернативный трепонемный тест (ИФА, если первый тест был РПГА, и наоборот — РПГА, если был ИФА). Если тест становится отрицательным, то кровь пациента направляют в экспертную лабораторию и проводят дополнительные анализы. В случае если второй трепонемный тест становится положительным, ставят диагноз: «скрытый сифилис».Такое состояние может наблюдаться некоторое время после проведенного лечения. Если пациенту было проведено до этого лечение, то для того чтобы подтвердить диагноз, проводят дополнительное исследование на IgM. При положительных результатах — диагноз подтверждается, но исследование все равно рекомендуется повторить через 2 недели. При отрицательных результатах сифилис опровергается.
  • Если нетрепонемный тест (РМП/RW/RPR) отрицательный, а трепонемный (РПГА/ИФА) положительный, то состояние может оцениваться как «поздний сифилис» или «отсутствие сифилиса», если пациенту было проведено ранее полноценное лечение. Для разграничения этих двух состояний проводят дополнительный тест на IgM (ИФАIgM, РИФ-абс-IgM, Иммуноблоттинг-IgM). Если IgM в крови имеются, ставят «поздний сифилис» и лечат. Если нет — пациент считается здоровым.
  • Если RPR (или RW/РМП) положительный, РПГА положительный, а ИФА отрицательный (или наоборот: РПГА «-» и ИФА « »), то результаты анализов вызывают сомнение и рекомендуется отправить кровь в экспертную лабораторию или провести альтернативные анализы (РИФ, Иммуноблоттинг).
  • Если нетрепонемный тест (PMП/RW/RPR) положительный, а трепонемный (РПГА/ИФА) отрицательный, то проводится дополнительный трепонемный тест (ИФА/РПГА). Если он дает положительный результат, то кровь направляют в экспертную лабораторию. Если отрицательный, то диагноз опровергается, а результат нетрепонемного теста признается ложноположительным.
RPR/
RW/
РМП
РПГА ИФА Лечение проводилось Диагноз Дальнейшая тактика
Скрытый сифилис ИФА/РИФ на IgM
Состояние после лечения Рекомендуется наблюдение у врача, повтор анализов через 2 недели
Сомнительный результат анализов Рекомендуется направить кровь в экспертную лабораторию
Сомнительный результат анализов Рекомендуется направить кровь в экспертную лабораторию
Сомнительный результат анализов Рекомендуется направить кровь в экспертную лабораторию
Ложноположительный результат. Пациент здоров Лечение не требуется
Состояние после лечения, пациент здоров Снятие с учета

Индикаторы эффективности лечения и безопасности методов диагностики и лечения

1. Бактериоскопия.

2. Методы серологического исследования (неспецифические и специфические).

3. Исследование спинномозговой жидкости (СМЖ).

4. Гистологическое исследование – преимущественно в стадии третичного сифилиса.

5. Бактериоскопическое исследование.

6. Микроскопическое исследование нативного препарата отделяемого эрозивных или язвенных высыпаний или пунктата из лимфоузла для выявления Treponema pallidum.

Материал со слизистых оболочек, кожи половых органов или экстрагенитальной области с подозрительными эрозивными или язвенными дефектами, непосредственно с поверхности твердого шанкра, широкой кондиломы, эрозивных папул получает врач лаборатории или любой другой врач в помещении, где подготовлен микроскоп с темным полем зрения.

Поверхность ulcus durum или эрозивных папул протирается тампоном, смоченным в физиологическом растворе, и затем раздражается бактериологической платиновой или вольфрамовой петлей несколько минут, пока из глубоких слоев не покажется прозрачная тканевая жидкость. Необходимо следить, чтобы к ней не примешивалась кровь, в противном случае это затруднит исследование.

https://www.youtube.com/watch?v=qn3IVOlc79s

Полученная жидкость переносится петлей на предметное стекло, куда при необходимости можно добавить физиологический раствор. Подготовленный препарат исследуется в темном поле микроскопа. Если результат негативный, исследование повторяется несколько дней подряд, а в промежутках между исследованиями применяются аппликации с физиологическим раствором.

Перед микроскопическим исследованием нельзя использовать антибиотики и местные антисептические средства!

Полученный материал с каплей физиологического раствора, помещенный на предметное стекло и накрытый покровным стеклом, исследуется под микроскопом с помощью объектива с 40-кратным увеличением и окуляра с 10-кратным увеличением. Для микроскопического подтверждения диагноза необходимо обнаружить, по крайней мере, 2-3 морфологически типичные, живые трепонемы с характерными движениями.

Диагноз первичного серонегативного сифилиса может быть подтвержден только при наличии бледных трепонем. У пациентов с приобретенным или с врожденным сифилисом трепонемы обнаруживаются во всех сифилидах как раннего, так и позднего сифилиса. Интенсивность тканевой реакции обратно пропорциональна количеству этих микроорганизмов, наибольшее количество которых находится в первичной сифиломе (твердый шанкр), в региональных лимфоузлах и папулах вторичного свежего сифилиса, а наименьшее – в поздних сифилидах. У пациентов с вторичным сифилисом бледные трепонемы могут обнаруживаться во всех органах.

В циркулирующей крови трепонемы могут присутствовать кратковременно только у пациентов с вторичным свежим сифилисом и ранним врожденным сифилисом. Кровь является неблагоприятной средой для трепонем, которую они быстро покидают, мигрируя в ткани. Чрезвычайно трудно обнаружить трепонемы в цереброспинальной жидкости даже у пациентов с tabes dorsalis и прогрессивным параличом.

Предлагаем ознакомиться:  Анализ на сифилис - как называется и как проводится

Сперма человека является инфекционной. Моча, пот, слюна не являются контагиозными, если они не соприкасаются с мокнущими высыпаниями. Напротив, в молоке матери трепонемы обнаруживаются. У больных сифилисом трепонемы можно выявить в пунктате лимфоузлов, в селезенке и в неспецифических повреждениях (в экссудате полостных элементов различного происхождения, например, в пузырьках herpes simplex). Метод характеризуется низкой себестоимостью, ответ можно получить в течение получаса.

Для быстрой диагностики сифилиса важно, чтобы больной не занимался самолечением. Если поверхность шанкра, кондиломы или эрозивной папулы покрыта корочкой, образовавшейся в результате вторичного инфицирования, ее следует очистить с помощью физраствора.

Раздражение поверхности элемента с целью получения тканевой жидкости необходимо выполнять очень осторожно, чтобы не вызвать кровотечение, поскольку наличие эритроцитов в микропрепарате затрудняет качественную диагностику. Исследование считается положительным только при обнаружении морфологически типичных трепонем с наличием, по крайней мере, 8 завитков и характерными движениями. Treponema pallidum необходимо дифференцировать с Т. refringens, Т. balantidis, Т. phagadenis, Т. gracilis, Т. macrodentinum, T.microdentinim.

В выявлении и подтверждении диагноза сифилиса, особенно в случае поздних и латентных форм заболевания, когда клинические проявления ничтожны или отсутствуют, решающее значение отдается серологическим методам диагностики. Отмечены случаи, когда о заболевании сифилисом свидетельствуют только полученные специфические положительные результаты тестирования при исследовании сыворотки или плазмы.

К неспецифическим (нетрепонемным) тестам, являющимся методами экспресс-диагностики сифилиса, относятся RPR (Rapid Plasma Reagins), тест с инактивированной сывороткой – МРП (микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном) и их модификации. Это так называемые флокуляционные тесты, где сформировавшийся в ходе реакции комплекс «антиген антитело» образует хлопья, которые различимы при помощи лупы.

В диагностике сифилиса нетрепонемные тесты используются в качестве скрининговых (отборочных) и не подходят для подтверждения диагноза сифилиса. Такие тесты применяются для обследования больших групп населения во время профилактических осмотров или в эпидемиологически неблагоприятной ситуации. Тесты достаточно чувствительны, технически просты, однако требуют специально обученного персонала.

https://www.youtube.com/watch?v=gH0kdNSliA4

Результаты тестирования должен оценивать и подтверждать врач. Для экспресс-диагностики используются преимущественно серологические тесты МРП и RPR. Чувствительность нетрепонемных тестов при ранних формах сифилиса составляет приблизительно 70%, в случае вторичного сифилиса – 100%, при латентных формах – 30%.

Неспецифические тесты могут давать ложноположительные результаты в 2-2,8% случаев. У отдельных категорий пациентов, например, у беременных, это число может увеличиваться до 3-3,5%. МРП и RPR становятся позитивными через 1 -4 недели после появления шанкра, то есть через 1-1,5 месяца после инфицирования.

Примерно в 2% случаев наблюдается так называемый феномен «прозоны», когда на фоне выраженной клинической картины сифилиса и положительных результатов специфических серологических реакций RPR могут не давать положительных результатов. В таких случаях положительный результат получают, разбавив образец сыворотки.

Количественные методы (определение титра антител) МРП и RPR используются для контроля эффективности лечения.

При соединении эмульсии кардиолипинового антигена с плазмой или сывороткой больного сифилисом образуется флокулят (комплекс «антиген антитело»), который выглядит как белые снежинки. У каждой из тест-систем (МРП, RPR) имеются свои технические особенности, однако принцип метода одинаков.

Исследуемый материал Плазма или сыворотка, используемые для анализа, должны быть прозрачными. Для тестирования не подходит хилезный или гемолизированный материал.

– Получение плазмы из капиллярной крови: кровь из пальца берут аналогично методике

определения СОЭ. В пипетку Панченко набирается 5% раствор цитрата натрия до отметки «К», а затем выливается обратно в бутылочку до отметки на пипетке «25». Оставшийся цитрат натрия сливается в пробирку для центрифуги, куда добавляют три пипетки крови из пальца пациента, набранной до отметки «К», и перемешивают.

Кровь оставляют при комнатной температуре до разделения плазмы и эритроцитов. Чтобы ускорить процесс, кровь можно центрифугировать. Полученную плазму забирают пипеткой Пастера или специальной пипеткой и используют для диагностики. Для получения плазмы рекомендуется применять специальные микроветы. Материал необходимо доставить в лабораторию в течение 4-6 часов.

– Получение инактивированной сыворотки: сыворотку собирают либо при ее отделении от сгустка при отстаивании крови, либо путем центрифугирования стерильно взятой крови из вены. В холодильнике сыворотку можно хранить при температуре 4°С до 5 дней. В лаборатории полученная сыворотка инактивируется при температуре 5б°С в течение 30 мин. Тестирование выполняется на прозрачных полистироловых пластинах с углублением (МРП) или на специальных картонных пластинах (RPR).

Результаты МРП читают в проходящем свете на черной основе или над световым источником невооруженным глазом или с помощью лупы. В углублениях, где находится плазма или сыворотка больного сифилисом в различных количествах образуются белые хлопья разного размера. Если в углублении отмечаются большие хлопья или их конгломераты, и окружающая жидкость становится прозрачной, результат считается положительным (4 , 3 ).

Предлагаем ознакомиться:  Раны при сифилисе — Советы медиков

Мелкие хлопья – результат слабо положительный (2 , 1 ). В отрицательном случае хлопья не образуются (негативный). В сомнительных случаях ( -) следует ориентироваться по «отрицательному контролю». Если в углублении отрицательного контроля хлопья не образуются, результат оценивается как сомнительный ( -).

1.2. Непрямые методы

Анализы на скрытый сифилис

В условиях оборудованных лабораторий и медицинских центров определение трепонем методом иммуноферментной реакции может производиться несколькими методами, которые называются прямыми и непрямыми. Однако в основе данных реакций лежит один способ, который позволяет произвести анализ на сифилис методом ИФА. Проводится данный тест определенным образом.

ВАЖНО ЗНАТЬ!

https://www.youtube.com/watch?v=ub8IrVYK8Zo

У врача лаборанта имеется специальный планшет – панель с лунками в виде углублений округлой формы в количестве до ста. Используются также специально приготовленные концентрированные антигены к сифилису в наборах для данного анализа, которые помещаются в лунки планшета ИФА. После взятия крови пациента в утренние часы натощак из крови отделяется сыворотка и помещается в лунки с антигенами. В лунках происходит реакция связывания антигена с антителами.

Метод ИФА на сифилис основан на реакции связывания иммунных соединений первого этапа и конъюгатов со специальной ферментной меткой, которая нужна для считывания качества реакции. На данном этапе помимо ферментной пероксидазы вносится хромогенные красящие вещества, для окрашивания материала в зависимости от исхода реакции.

На основании появившихся окрашенных лунок в планшете производится расшифровка теста. В наборах к различным методам ИФА прилагаются таблицы цветовых схем, по которым определяется количество, уровень иммуноглобулинов, антител из сыворотки пациента в 1 единице объема.

Также для оценки исхода реакции используется специальное оборудование — спектрофотометр для проведения фотометрирования и оценки плотности материала в лунках по сравнению с контрольными пробами. На основании плотности и получают результат, четко установленный для каждого возбудителя сифилиса в пределах норм и патологии.

Иммуноферментный анализ (сокращенно ИФА) базируется на специфической реакции антиген-антитело. Биологический материал (сыворотка крови пациента, ликвор) вносят в лунки, на твердой поверхности которых фиксированы антигены бледной трепонемы. Исследуемый материал инкубируют, затем отмывают антитела, не связавшиеся с антигенами (см. рисунок 5).

Идентификация полученного комплекса осуществляется на этапе ферментации с помощью иммунной сыворотки, меченной ферментом. При химической реакции фермент окрашивает полученные комплексы. Интенсивность окрашивания зависит от количества специфических антител в крови пациента и фиксируется спектрофотометром.

Чувствительность ИФА составляет более 95% . Метод используется в автоматизированном режиме для исследования декретируемых групп населения: доноров, беременных и других, для уточнения диагноза при положительных и ложноположительных нетрепонемных тестах.

Как правило, постоянно при обращении в поликлинику, доктора назначают сдавать разные анализы. Это позволяет им определить инфекции и заболевания, которыми страдает человек. ИФА или так называемый иммуноферментный анализ, это прекрасный способ оценить иммунную систему организма, и выявить по наличию антител инфицирование и стадию болезни.

Учитывая, что большое количество паразитов проникают в человеческий организм, сдавать анализы и проверять свой его желательно каждому человеку, чтобы в один прекрасный день не получить положительный результат на инфекцию.

Анализ позволяет выявлять вещества и паразитов, которые чужды человеческому организму – антигенны, и выявление иммуноглобинов. Это не только позволяет определить заболевание, но диагностировать стадию. Результаты анализа ИФА выдаются как количественно, так и качественно.

Итак, кому назначают сдавать данный анализ и что такое иммуноферментный анализ? Доктора выписывают этот анализ, если у человека проявляются следующие заболевания:

  • Сыпь на теле – аллергические реакции.
  • Вирусы – герпес, цитомегалавирус.
  • Болезни, передаваемые половым путем – сифилис, трихомонада.
  • Патология, связанная с онкологическим заболеванием.
  • Нейросифилис.

Кроме перечисленных заболеваний, анализ назначается для определения уровня гормона в крови. По результатам проводится оценка качества терапии. Что такое сифилис знает наверно каждый человек, но не представляет его масштабы, и сколько человек инфицированных ходят рядом с нами.

В настоящее время сифилис – это самое распространенное заболевание. Это трепонома, которая поражает организм человека. И в результате затрагиваются все внутренние органы заболевшего.

Проникновение паразитов в организм, вызывает инфицирование человека. Этим венерическим заболеванием можно заразиться не только половым путем, но и бытовым методом, стоит это помнить, и соблюдать простые правила профилактики.

Это очень опасная инфекция, и частенько бывает, что она может долгое время себя не проявлять. Поэтому человек может быть носителем и распространителем большое время, не зная, что он болен.

Если говорит об анализе ИФА на сифилис, то в этом случае сложно сказать, что есть норма или отклонение. Результат, как правило бывают или отрицательный, или положительный. Кроме этого существуют титры, определяющие количество антител в крови.

Существует много тонкостей при расшифровке анализа, если он показал положительный результат, анализ все равно придется пересдавать несколько раз, чтобы исключить метод ложноположительной реакции.

<table width="

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:

Отправить ответ

avatar
  Subscribe  
Notify of
Adblock detector